مقدمه
بافت‌شناسی پزشکی، مطالعه میکروسکوپی بافت‌ها و اندام‌ها از طریق برش‌زدن، رنگ‌آمیزی و بررسی این برش‌ها در زیر میکروسکوپ است. بافت‌شناسی که اغلب «آناتومی میکروسکوپی» و «هیستوشیمی» نیز نامیده می‌شود، امکان مشاهده ساختار بافت و تغییرات مشخصی را که ممکن است بافت متحمل شده باشد، فراهم می‌کند. به همین دلیل، در تشخیص‌های پزشکی، مطالعات علمی، کالبدشکافی و تحقیقات قانونی کاربرد فراوانی دارد. پس از اینکه نمونه بافتی مراحل تثبیت، آماده‌سازی، قالب‌گیری، برش‌زدن و رنگ‌آمیزی را پشت سر گذاشت، می‌توان آن را با میکروسکوپ تحلیل کرد و یافته‌های آن را توسط یک متخصص آسیب‌شناسی (پاتولوژیست) تفسیر نمود. رنگ‌های بافت‌شناسی که برای یک نمونه خاص انتخاب می‌شوند، به سوال پژوهشیِ مطرح‌شده بستگی دارند. تفسیر پیشرفته لام بافت‌شناسی در ترکیب با سابقه پزشکی بیمار می‌تواند تأثیر بسیار ارزشمندی بر روند درمان و پیش‌آگهی بیماری داشته باشد.
مسائل نگران‌کننده
دانش پایه‌ای درباره آماده‌سازی بافت، از جمله رنگ‌آمیزی آن، هنگام تفسیر گزارش‌های آسیب‌شناسی مربوط به بیوپسی‌های بستری یا سرپایی اهمیت زیادی دارد. همیشه این‌طور نیست که پاتولوژیستِ تفسیرکننده، نمونه بافتی را با به‌کارگیری رنگ‌آمیزی بافت‌شناسی مناسب به طور کامل بررسی کرده باشد و این کاستی می‌تواند تشخیص دقیق را به تأخیر بیندازد.
ساختار
چهار نوع اصلی از بافت‌های انسانی را می‌توان با استفاده از تکنیک‌های مختلف بافت‌شناسی رنگ‌آمیزی و مشاهده کرد. بافت پوششی (اپیتلیوم)، بافت همبند، بافت عضلانی و بافت عصبی اشتراکاتی با هم دارند، اما پس از رنگ‌آمیزی، از نظر ساختاری بسیار متمایز به نظر می‌رسند. هر رنگ برای برجسته کردن یک ویژگی یا جزء مهم در یک نوع بافت به کار می‌رود. برای مثال، یکی از رایج‌ترین رنگ‌ها یعنی «هماتوکسیلین»، یک رنگ پایه است که اسیدهای نوکلئیک (مانند DNA و RNA) را به رنگ آبی درمی‌آورد، در حالی که «ائوزین» پروتئین‌ها را صورتی می‌کند. این دو رنگ معمولاً با هم استفاده می‌شوند تا ارگانل‌ها و پروتئین‌های درون سلولی را مشخص کنند. به دلیل تنوع پروتئین‌های موجود، برخی رنگ‌ها برای برجسته کردن یک پروتئین خاص ساخته شده‌اند که در بخش‌های بعدی این مقاله به آن‌ها خواهیم پرداخت. مزیت استفاده از یک رنگ اختصاصی این است که می‌تواند آن پروتئین خاص را بسیار به خوبی برجسته کند؛ با این حال، به دلیل همین اختصاصی بودن، سایر ساختارها دیده نخواهند شد. به همین دلیل، اغلب چندین لام از یک نمونه تهیه می‌شود تا بتوان از رنگ‌های گوناگون برای جمع‌آوری طیف کامل اطلاعات مورد نیاز استفاده کرد.
عملکرد
تقریباً تمام رنگ‌آمیزی‌های بافتی روی بافتی انجام می‌شوند که از بدن خارج شده است. با این حال، در موارد نادر، رنگ‌های بسیار تخصصی به نام «رنگ‌های حیاتی» می‌توانند روی بافتی که در داخل بدن باقی مانده است عمل کنند. این رنگ‌ها برای شناسایی انواع خاصی از بافت و تشخیص بافت‌های غیرطبیعی به کار می‌روند تا بیوپسی بعدی در به‌دست آوردن بافت غیرطبیعی دقت بیشتری داشته باشد.
آماده‌سازی بافت
پیش از اینکه رنگ‌آمیزی اختصاصی انجام شود، نمونه‌های بافتی باید مراحل آماده‌سازی زیر را طی کنند: تثبیت، پردازش، قالب‌گیری، برش‌زدن و گاهی اوقات بازیابی آنتی‌ژن. در آزمایشگاه‌های مدرن بافت‌شناسی، بیشتر این مراحل به صورت خودکار انجام می‌شوند.
تثبیت (Fixation): در این مرحله از مواد شیمیایی برای حفظ ساختار بافت در شکل طبیعی‌شان استفاده می‌شود و با اتصال متقابل و برگشت‌ناپذیر پروتئین‌ها، بافت را در برابر تخریب محافظت می‌کند. اگرچه چندین تثبیت‌کننده تخصصی در دسترس است، اما «فرمالین بافر خنثی» یک انتخاب رایج برای این مرحله محسوب می‌شود. مرحله تثبیت برای بقیه مراحل رنگ‌آمیزی بافت‌شناسی حیاتی است؛ زیرا با حفظ ترکیب شیمیایی بافت، نمونه سخت‌تر شده و مرحله برش‌زدن را آسان‌تر می‌سازد. «پارافین-فرمالین» تثبیت‌کننده مؤثر دیگری است؛ مزیت آن این است که تثبیت‌کننده انتخابی برای ایمونوهیستوشیمیایی (رنگ‌آمیزی ایمنی) به شمار می‌رود، با این حال نیازمند آماده‌سازی در زمان تثبیت است. «بوئن» نیز تثبیت‌کننده‌ای است که برای بررسی بافت جنین و مغز استفاده می‌شود، زیرا در حفظ هسته‌های ظریف و گلیکوژن بسیار عالی عمل می‌کند. نکته منفی آن این است که بافت‌های کلیه را به خوبی حفظ نمی‌کند و ساختار میتوکندری را نیز دچار تحریف می‌سازد.
آب‌گیری (Dehydration): افزودن اتانول باعث آب‌زدایی از نمونه می‌شود. این کار آب را از نمونه خارج کرده و بافت را برای میکروسکوپ نوری نهایی بیشتر سخت می‌کند. پس از اعمال اتانول و به دنبال تکمیل آب‌زدایی بافت، از زایلن برای خارج کردن اتانول استفاده می‌شود.
قالب‌گیری (Embedding): قالب‌گیری فرآیند قرار دادن نمونه در موم پارافین یا رزین پلاستیکی است تا فرآیند استخراج ساختارهای سلولی بهبود یابد. این مرحله باید با احتیاط انجام شود، زیرا اگر هدف انجام رنگ‌آمیزی ایمنی (ایمونوهیستوشیمیایی) باشد، موم پارافین مانع از نفوذ پادتن‌ها (آنتی‌بادی‌ها) شده و به نتیجه‌ای نادرست منجر خواهد شد.
برش‌زدن (Sectioning): برش‌زدن شامل سوار کردن نمونه روی میکروتوم و بریدن آن به بخش‌های نازک است. ضخامت ترجیح‌داده‌شده ۴ تا ۵ میکرومتر است تا بتوان آن را رنگ‌آمیزی کرده و برای بررسی روی لام میکروسکوپ قرار داد.
بازیابی آنتی‌ژن (Antigen Retrieval): این مرحله برای بازیابی آنتی‌ژن‌هایی است که ممکن است در مراحل تثبیت و قالب‌گیری پوشانده شده باشند. اگر اتصالات متقابل پروتئین‌ها، جایگاه‌های آنتی‌ژنی را مخفی کنند، ممکن است پاسخ ایمونوهیستوشیمیایی چندان قوی نباشد. بازیابی آنتی‌ژن از طریق روش‌های حرارتی و پروتئولیتیک انجام می‌شود تا اتصالات متقابل شکسته شده و اپی‌توپ‌ها و آنتی‌ژن‌هایی که قبلاً پوشانده شده بودند، آشکار گردند. اگرچه این مرحله خطر تغییر ماهیت دادن (دناتوره شدن) هم تثبیت‌کننده و هم خود آنتی‌ژن‌ها را به همراه دارد، اما یک روش موفقیت‌آمیز در بازیابی آنتی‌ژن می‌تواند به رنگ‌آمیزی ایمنی بسیار مؤثرتری منجر شود.
هیستوشیمی و سیتوشیمی
هماتوکسیلین و ائوزین (H&E)
همان‌طور که از نام آن پیداست، این روش شامل دو رنگ‌آمیزی در مراحل متوالی است. هماتوکسیلین یک رنگ پایه (بازی) است که ساختارهای اسیدی را رنگ می‌کند. رنگ حاصل، طیفی از بنفش/آبی است و ساختارهایی که با این رنگ هدف قرار می‌گیرند، «بازوفیل» نامیده می‌شوند. ساختارهای بازوفیل شامل DNA در هسته سلول‌ها، RNA در ریبوزوم‌ها و شبکه آندوپلاسمی زبر هستند.
ائوزین یک رنگ متضاد (رنگ مکمل) است که پس از هماتوکسیلین انجام می‌شود و یک رنگ اسیدی است که ساختارهای پایه را هدف قرار می‌دهد. رنگ حاصل طیفی از صورتی/قرمز است و ساختارهایی که ائوزین را جذب می‌کنند، «ائوزینوفیل» نامیده می‌شوند. سیتوپلاسم نمونه‌ای از یک ساختار ائوزینوفیل است.
رنگ‌آمیزی گرم (Gram Stain)
رنگ گرم یک تکنیک رنگ‌آمیزی متوالی است که برای تمایز گونه‌های باکتریایی ابداع شده است. کاربرد اصلی آن در تعیین ارگانیسم عامل عفونت باکتریایی از طریق رنگ‌آمیزی دیواره سلولی است. اگرچه همه باکتری‌ها دیواره سلولی ندارند و بنابراین نمی‌توان آن‌ها را با این روش رنگ‌آمیزی کرد، اما این روش همچنان یک رنگ بسیار مفید و رایج است. نمونه باکتریایی را می‌توان با حرارت تثبیت کرد و طی چهار مرحله رنگ گرم را روی آن انجام داد: رنگ‌آمیزی اولیه با کریستال ویولت، رنگ‌آمیزی ثانویه با ید گرم، رنگ‌زدایی با الکل یا استون، و رنگ متضاد با سافرانین. باکتری‌های گرم‌مثبت آنهایی هستند که دارای لایه ضخیمی از پپتیدوگلیکان هستند و باعث می‌شوند رنگ بنفش را حفظ کرده و به رنگ بنفش دیده شوند. در مقابل، باکتری‌های گرام‌منفی دارای لایه نازکی از پپتیدوگلیکان و لیپیدهای بیشتری در دیواره سلولی هستند، بنابراین مرحله رنگ‌زدایی، رنگ بنفش را بیشتر شسته و نمونه به رنگ صورتی دیده می‌شود.
رنگ‌آمیزی گیمسا (Giemsa Stain)
رنگ گیمسا معمولاً در هماتولوژی به دلیل توانایی برتر آن در رنگ‌آمیزی مغز استخوان، سلول‌های پلاسما و ماست‌سل‌ها استفاده می‌شود. همچنین برای شناسایی انگل‌های خونی بسیار محبوب است. رنگ گیمسا همچنین می‌تواند به تجسم ناهنجاری‌های کروموزومی از طریق «باندهای مبتنی بر گیمسا» یا مشاهده بخش‌های نوکلئوتیدی تیره‌تر و روشن‌تر جایگزین روی کروموزوم‌ها در طول تقسیم میتوز کمک کند.
واکنش اسید پریودیک شیف (PAS)
واکنش اسید پریودیک شیف که اغلب «رنگ پاس (PAS)» نامیده می‌شود، روشی برای بررسی ساختارهایی است که مقادیر زیادی مولکول کربوهیدرات دارند؛ مانند حاشیه مسواکی روده، سلول‌های توبولار کلیه، مخاط و الیاف رتیکولار بافت همبند. گلیکوژن، گلیکوپروتئین، گلیکولیپیدها و موسین‌ها پس از تکمیل رنگ‌آمیزی به رنگ قرمز یا سرخابی درمی‌آیند. اسید پریودیک که یک ید بسیار اکسید شده است، گروه‌های هیدروکسیل مولکول‌های قند مجاور را اکسید کرده تا آلدئیدها تولید شوند. پس از این مرحله، معرف شیف به آلدئید متصل شده و یک رنگ قرمز سرخابی برای مشاهده ایجاد می‌کند.
تری‌کرم ماسون (Masson’s Trichrome)
رنگ تری‌کرم ماسون رنگی است که می‌تواند نتیجه‌ای چندرنگ روی بافت ایجاد کند. با وجود اینکه دارای رنگ‌های متضاد قرمز است، اما به خاطر توانایی‌اش در رنگ کردن الیاف کلاژن به رنگ آبی محبوبیت دارد. تری‌کرم ماسون می‌تواند فیبروز قلبی، فیبروز ریوی، بیماری مزمن کلیوی و دیستروفی عضلانی را شناسایی کند.
کنگو رد (Congo Red)
کنگو رد یک رنگ آبی محلول در آب است که در pH بین ۳.۰ تا ۵.۰ یک محلول قرمز ایجاد می‌کند. حلقه‌های آروماتیک فراوان آن می‌توانند از طریق برهم‌کنش‌های آب‌گریز روی هم انباشته شده و در بافت جمع شوند. نکته قابل توجه این است که رنگ کنگو رد می‌تواند الیاف آمیلوئید را به رنگ قرمز و نارنجی رنگ کند و آن را به ابزاری مفید در مطالعه آمیلوئیدوز تبدیل نماید. هنگامی که بافت‌های رنگ‌شده با کنگو رد که سرشار از آمیلوئید هستند در زیر نور پلاریزه در میکروسکوپ مشاهده شوند، دوشکستی (بایرفرینس) سبز «سیبی» روشن نشان می‌دهند.
پروس بلو (Prussian Blue)
رنگ پروس بلو برای شناسایی ذخایر آهن در بدن مفید است. این رنگ به این صورت عمل می‌کند که ابتدا بافت را با اسید هیدروکلریک رنگ می‌کند و سپس یون‌های فریک واکنش نشان داده و رنگدانه آبی روشن نامحلول را تشکیل می‌دهند. این روش در تشخیص حالات تجمع آهن مانند هموکروماتوز یا هموسیدروز از طریق رنگ‌آمیزی بافت کبد و مشاهده تجمع آهن در نزدیکی هپاتوسیت‌های پری‌پورتال یا در امتداد پوشش سینوسی مفید است. فراوانی بیش از حد ذخایر آهن در مغز استخوان می‌تواند نشانه اریتروپوزیس (گلبول‌سازی) ناکارآمد باشد، مانند کم‌خونی ناشی از بیماری مزمن. از طرف دیگر، عدم واکنش به رنگ پروس بلو می‌تواند نشان‌دهنده سطح پایین آهن باشد، مانند کم‌خونی فقر آهن.
موسیکارمین (Mucicarmine)
موسیکارمین، موسین (یک ترشح تولید شده در سلول‌های اپیتلیومی و بافت همبند) را رنگ می‌کند. آلومینیوم و کارمین با هم ترکیب می‌شوند تا یک کمپلکس کلات‌کننده با بار مثبت تشکیل دهند. بار مثبت جدید به موسین متصل می‌شود، آن را قرمز می‌کند و امکان مشاهده‌اش را فراهم می‌سازد. این رنگ در شناسایی کارسینوم‌های احتمالی و شرایط التهابی که در آن‌ها تولید بیش از حد موسین وجود دارد، مفید است. در جراحی، رنگ‌آمیزی موسیکارمین همچنین می‌تواند با رنگ‌آمیزی اپیتلیوم ترشح‌کننده مخاط در ناحیه‌ای که حاوی سلول‌های تولیدکننده مخاط نیست، محل تومور اولیه را تعیین کند. موسیکارمین همچنین کپسول ژلاتینی قارچ کریپتوکوکوس را رنگ می‌کند.
سودان بلک (Sudan Black)
رنگ سودان بلک ساختارهای حاوی چربی مانند تری‌گلیسیریدها و لیپوپروتئین‌ها را به رنگ سیاه یا قهوه‌ای تیره رنگ می‌کند. آماده‌سازی بافت برای سودان بلک و اویل رد او، مرحله آب‌زدایی با الکل را رد می‌کند تا از شسته شدن چربی‌هایی که قرار است رنگ شوند جلوگیری شود. این رنگ ممکن است برای تشخیص آترواسکلروز با رنگ‌آمیزی پلاک‌های آترواسکلروتیک و لوکودیستروفی غالب اتوزومی با رنگ‌آمیزی ماکروفاژها در ماده سفید پس از بیوپسی مغز پس از مرگ استفاده شود.
اویل رد او (Oil Red O)
مشابه رنگ سودان بلک، اویل رد او رایج‌ترین رنگی است که روی چربی‌ها یا لیپیدهای آب‌گریز (موادی که رنگ‌آمیزی آن‌ها به طور سنتی دشوار است) استفاده می‌شود. اویل رد او کاربرد بالایی در تجسم پلاک‌های آترواسکلروتیک و تجمع لیپیدهای کبدی و عضلانی دارد.
رنگ‌آمیزی نقره (Silver Stain)
رنگ‌های نقره دسته بزرگ‌تری از رنگ‌ها هستند که برای مطالعه هیستوپاتولوژیک بیماری‌های مبتنی بر تجمع در مغز و اعصاب استفاده می‌شوند. چندین روش برای رنگ‌آمیزی نقره وجود دارد، از جمله بیلشوسکی، گالیاس، بودیان و کمپبل-سوئیتر. روش رنگ‌آمیزی انتخاب‌شده به ضایعه عصبی مورد نظر بستگی دارد، زیرا هر روش نشان‌دهنده حساسیت و ویژگی متفاوتی است. به طور کلی، این روش‌ها یون‌های نقره یا کمپلکس‌های نمکی را به بافت هدف متصل می‌کنند. سپس، آن‌ها باید درجا (in situ) احیا شوند و ذرات نقره بعدی تجمع یافته و قابل تجزیه‌وتحلیل هستند. اخیراً از فلورولابلیت (نشانه‌گذاری با فلورسانس) استفاده شده است، جایی که یک نیمه‌هادی فلوروژنیک نانوذرات کوچک ۶ نانومتری را در محل رسوب نقره آزاد کرده و رنگ‌هایی تولید می‌کند. محدوده قطر ذرات نقره‌ای که تشکیل می‌شوند با رنگ‌های مختلف همبستگی دارد؛ برای مثال، قطرهای بین ۱۰ تا ۲۰ نانومتر طیفی از رنگ‌های زرد را ایجاد می‌کنند در حالی که قطرهای بیش از ۱۰۰ نانومتر رنگ سیاه را به وجود می‌آورند.
رنگ‌های نقره به خاطر تشخیص پروتئین بتا-آمیلوئید (Aβ) در بیماری آلزایمر و اجسام پیک در بیماری پیک بسیار شناخته شده هستند. هنگام رنگ‌آمیزی، پلاک‌های آمیلوئید تیره‌تر می‌شوند و بسته به اندازه یا مقدار پلاک‌های آمیلوئید می‌توانند از زرد تا سیاه متغیر باشند.
رنگ‌آمیزی نیسل (Nissl Stain)
رنگ نیسل که به نام رنگ «کریزیل ویولت» نیز شناخته می‌شود، از رنگ آنیلین پایه برای مطالعه ساختار نورونی در مغز و نخاع استفاده می‌کند. نوروپیل به رنگ بنفش مایل به آبی و دانه‌دانه رنگ می‌شود. ماده نیسل دارای مقدار زیادی RNA ریبوزومی است، بنابراین رنگ را جذب کرده، به رنگ آبی تیره ظاهر می‌شود و سیتوپلاسم را متراکم و منقوش نشان می‌دهد. مزیت استفاده از رنگ نیسل برای ارزیابی آسیب‌شناسی عصبی این است که سیتوپلاسم نورونی را به طور قابل تشخیصی بدون رنگ کردن پریکاریون سایر ساختارهای سلولی مانند آستروسیت‌ها رنگ می‌کند.
رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو (Papanicolaou Stain)
رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو (که تست پاپ اسمیر بر پایه آن انجام می‌شود)، یک تکنیک رنگ‌آمیزی سیتولوژیک است که بیشتر به خاطر تشخیص سرطان دهانه رحم در بیماران زن شناخته شده است. سلول‌های مورد نظر برای رنگ‌آمیزی از اسمیرهای زنان، نمونه‌های خلط، برس‌زدن‌ها، مواد آسپیراسیون با سوزن باریک و شستشوها جمع‌آوری می‌شوند. این رنگ چندرنگی شامل پنج رنگ است: هماتوکسیلین برای هسته، اورنج G برای کراتین، ائوزین برای ساختارهای سطحی، لایت گرین SF برای سیتوپلاسم و بیسمارک براون. در زمینه تست پاپ اسمیر برای غربالگری سرطان دهانه رحم، رنگ‌آمیزی سلول‌های اپیتلیومی ناحیه انتقال دهانه رحم برای تحلیل فرآیندهای پیش‌سرطانی و سرطانی به کار می‌رود. اغلب لام دوم برای رنگ‌آمیزی ایمنی با بیومارکر p16INK4a جهت شناسایی دیسپلازی آماده می‌شود.
میکروسکوپ نوری
میکروسکوپ نوری که به آن میکروسکوپ اپتیکال نیز می‌گویند، می‌تواند برای مشاهده نمونه‌های زنده یا مرده استفاده شود. بزرگ‌نمایی آن نسبت به میکروسکوپ‌های الکترونی کمتر و در حدود ۱۵۰۰ برابر است. روش روشنایی آن به جای پرتو الکترون، نور لامپ روی میکروسکوپ است. میکروسکوپ نوری برای اکثر رنگ‌های توصیف‌شده در این مقاله مانند رنگ گرم، H&E و گیمسا استفاده می‌شود.
میکروسکوپ الکترونی
میکروسکوپ الکترونی برای مشاهده اجزای درون‌سلولی که با میکروسکوپ نوری قابل دیدن نیستند مفید است که این امر به شفاف‌سازی زیست‌شناسی بافت‌ها و سلول‌های غیرطبیعی کمک می‌کند. میکروسکوپ الکترونی معمولاً ۱۰۰ تا ۳۰۰ برابر بیشتر از بالاترین بزرگ‌نمایی میکروسکوپ نوری بزرگ‌نمایی می‌کند. به طور معمول، برش‌ها باید بسیار نازک بریده شوند تا نفوذ مناسب الکترون‌ها امکان‌پذیر باشد. مفیدترین رنگ‌های بافت‌شناسی برای میکروسکوپ الکترونی آنهایی هستند که دارای نمک‌های فلزی سنگین هستند، زیرا کنتراست فازی لازم برای مشاهده ساختارها را ایجاد می‌کنند. میکروسکوپ‌های الکترونی عبوری (TEM) برای بررسی ساختارهای درون‌سلولی بهتر هستند، در حالی که میکروسکوپ‌های الکترونی روبشی (SEM) معمولاً انتخاب مناسبی برای ساختارهای سطحی محسوب می‌شوند.
پاتوفیزیولوژی
استفاده از رنگ‌های تخصصی برای بافت‌ها نه تنها در تشخیص تغییرات ساختاری بافت‌ها کمک می‌کند، بلکه پزشک را از تغییرات عملکرد بافت که برای تشخیص بسیار حائز اهمیت است مطلع می‌سازد؛ مواردی مانند تجمع غیرطبیعی آهن، تجمع غیرطبیعی پروتئین (آمیلوئیدوز، پاراپروتئینمی و غیره)، تجمع غیرطبیعی گلیکوژن یا سایر کربوهیدرات‌ها و تجمع غیرطبیعی چربی. رنگ‌آمیزی‌های بسیار تخصصی می‌توانند بسیاری از تغییرات دیگر در فیزیولوژی سلولی را تشخیص دهند.
اهمیت بالینی
رنگ‌آمیزی و بررسی بافت‌شناسی اهمیت بالینی بسیار بالایی در تشخیص و درمان پزشکی در تقریباً تمام رشته‌های پزشکی دارد. بررسی بافت‌شناسی استاندارد طلایی برای تشخیص بسیاری از بیماری‌های پاتولوژیک است که رنگ‌آمیزی جزء ضروری آن محسوب می‌شود. تحلیل هیستوشیمیایی یک نمونه بافتی به پاتولوژیست اجازه می‌دهد نه تنها بیماری را تشخیص دهد، بلکه شدت بیماری را تعیین کرده و پیش‌آگهی آن را اعلام نماید.
منبع: NCBI
